Sechs Monate nach ihrem Bruder Philipp, am 3. April 1497 ging Margarete die Ehe mit Johann von Aragon und Kastilien ein. Dieser starb jedoch am 4. Oktober desselben Jahres. Wenige Wochen später brachte Margarete ein totgeborenes Kind zur Welt.
Nach ihrer Rückkehr in die Niederlande wurde sie Taufpatin ihres Neffen, dem späteren Karl V. Im Jahr 1501 wurde Margarete mit Philibert von Savoyen vermählt, doch auch dieser verstarb nur drei Jahre später.
Zu einer weiteren Ehe konnte sie ihr Vater dann nicht mehr überreden. Margarete wurde 1507 zur Statthalterin der habsburgischen Niederlande ernannt und versuchte ihr Erbe, das Herzogtum Burgund, zurückzugewinnen. Sie starb am 1. Dezember 1530 in Mechelen.