Sei mesi dopo suo fratello Filippo, il 3 aprile 1497 Margherita si unì in matrimonio con Giovanni di Aragona e Castiglia, il quale tuttavia morì il 4 ottobre dello stesso anno. Pochi mesi dopo, Margherita diede alla luce un bambino morto.
Tornata nei Paesi Bassi divenne madrina del nipote, in seguito Carlo V. Nel 1501 Margherita fu data in sposa a Filippo di Savoia, anch’egli morto di lì a tre anni.
Nonostante le insistenze del padre, Margherita non contrasse un terzo matrimonio. Nel 1507 fu invece nominata governatrice dei Paesi Bassi del regno asburgico cercando di riconquistare il ducato di Borgogna. Morì a Malines il 1° dicembre 1530.